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幾種酵母轉化方法
更新時間:2012-05-04   點擊次數:9479次

幾種酵母轉化方法

酵母轉化原理:
像釀酒酵母,線性化的轉化DNAPichiapastoris基因組的同源區域發生同源重組,使得線性化DNA產生穩定的轉化子(Cregg et al., 1985; Cregg etal.,1989).這樣的整合方式顯示*的穩定性,即使多拷貝轉化子在沒有選擇壓力的情況下也很穩定.單交換事件插入比雙交換事件置換發生幾率更大.單插入事件中約發生1-10%概率的多插入事件.

電轉化注意點:
一、  制備感受態的菌液收集時間:
1、準確測定OD值:OD1.21.5之間。
1) 為了準確測定OD值,建議將菌液稀釋不同濃度測定(124816倍稀釋,看其OD值是否呈線性關系)。每個倍數做35個重復,應該可以大致推斷OD值是否準確!菌液看上去渾濁,但OD值不高,很可能OD稀釋倍數不夠!
2) OD值是否測準也可以這樣估算:OD60040左右時,菌體濕重(6000rpm離心5min)約0.95g/10ml。高密度發酵時菌體濕重將相應下降。
275ml的菌,經18h左右的培養,zui后sorbital洗滌完畢后,50ml離心管里所剩菌體特別濃,需要1mlsorbitol才可溶解為糊狀。正常培養的OD1.21.5之間的500ml菌液,收集的感受態也用1ml稀釋的,沒那么粘稠。可以看看降低培養溫度(27攝氏度)或縮短培養時間(12h)。
   3、甚至不用轉接,直接挑單克隆在50100mlYPD中搖過夜,效果也很好

二、制備感受態的菌液量
如果只轉一個樣品,50ml就夠了,一般50ml的培養液如果OD值正常的話夠做10管感受態的,其他的按比例縮小。用大試管搖5ml菌液,然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受態,每一步的離心時間30秒就行。整個流程時間短,制備好的感受態用來做轉化的效率很高。
山梨醇離心,洗滌的過程之后的重懸的時候注意濃度,不要過于粘稠和稀釋。

三、感受態的保存
感受態細胞做好后由于電轉化杯還沒有處理好等原因,在冰上放幾個小時再做可能有一定的影響,盡量馬上制備馬上轉化。如果感受態細胞要保存,不需要加甘油,一般80ul EP管分裝,-70 或 -80 攝氏度保存。

另附:酵母GS115點種分離純化
接種GS1155ml YPD液體培養基,30200rpm振蕩過夜,涂布 YPD平板,30培養48 小時,用 YNB基本培養基和含His的補充培養基作點種分離純化,挑選在補充培養基生上生長而在基本培養基上不生長的單菌落劃YPD平板,4保存。

四、電轉化注意點:
1、感受態做好后,zui后一次吸出sorbital時,不是直接倒調的,而是用毛細管輕吸出來的,這樣可能使剩下的感受態純凈些。
    2、zui后用毛細管取出100ul出來,加入質粒,混勻!(怕量不夠,吸得很多,電轉時效果反而不好。 )
3、電轉杯清潔處理:一般先沖洗,洗凈;然后浸泡在75%的乙醇中;使用前我們都是放在超凈臺上,開啟紫外,邊吹風晾干,邊進行紫外照射。電轉杯的新包裝或重復使用可能對轉化率有一定的影響。
4、電擊的時候,電壓數以及電擊時間可以摸索一下,適當增加電壓或者延長電擊時間都可以。電擊條件比如1.5kv,放電4.85.5ms。電擊所有過程都要盡量在冰上進行,電擊時間可以減少一點,設置為5ms左右,電擊之后馬上加入預冷的山梨醇溶液,轉移至EP管,30度靜止培養1h。如果菌體懸液濃度比較大的時候,在制備感受態的時候要留心一下操作中的問題了。
    5、電擊之后,加入1ml的山梨醇,吸入1.5mlep管中,置于30度搖床低速培養1h,再涂板。
    6、注意的是處理液中的DTT是在使用前加入,其它配好后于4度保存,DTT單獨于-20度保存,可配成100倍的貯備液。
7、轉化后1mlsorbitol重懸的細胞懸液不能全部涂在一塊板子上,按標準程序制作的感受態一般3塊左右可能比較合適,以干燥后看見一薄層淡淡的白色為宜。轉化子會在白色的薄層上長出圓韻、飽滿的大菌落的。

五、轉化試劑和培養基的正確準備方法
1MD板子提前幾天做好,放在冰箱里,涂板的時候吸收效果會好些。如果是新板子,可能吸收不是太好,板子上有些積層,反而不利于生長。
    2YNB42度水浴一會,然后過濾除菌,YNB是加到培養基里面的,去離子水pH偏低,建議直接用蒸餾水就可以(關系不是太大)。
3、山梨醇,以及無菌去離子水均是冰凍,存放在4度冰箱中
4、一般用10ug以上質粒用SalI酶切,然后直接加乙醇沉淀,70%乙醇洗一遍,約20ulddH2O重溶。轉化效率一般大于100個克隆每ugDNA。有人用LiClDTT處理細胞,轉化效率很高,可以試試。建議你不要用膠回收kit,回收的DNA可能還有鹽,導致電擊時放電時間很短。

5個電轉化方案
方法一:
1.收集菌體
1mlGS115過夜培養物(OD6-10) 分裝到1.5ml EP管中,410000g 離心1min,棄上清,沉淀用無菌水(4洗滌,同樣條件下離心,棄上清。
2.菌體處理
加入1ml處理液,室溫下放置20min
處理液:
10mM LiAc
10mM DTT
0.6M sorbitol
10mM TrisHCl(pH7.5)
3.離心,棄上清,加入1ml 1M sorbitol ,離心,棄上清,
4.1M sorbitol洗滌二次,到zui終體積約為80μl.(菌體太多可適當棄去部分)
5.加入10μl.經過Bgl酶切處理的工程質粒,混勻后轉入 電擊杯中,冰浴5min.
6.電轉. 1.5kv25μF200Ω條件下進行電轉。
7.電擊后立刻加入1mL 1M sorbitol,吸出后于30培養2h
8.取一定量涂平板(YPDS + Zeocin,涂布的量分別為100200微升,剩余的經離心處理后全部涂在一個平板上

有一點要注意的是處理液中的DTT是在使用前加入,其它配好后于4度保存,DTT單獨于-20度保存,可配成100倍的貯備液。

方法二:按下面步驟轉化,開始每個板子只長了一二十菌落;小細節修改后,每個板長了約100.
步驟如下:
1、目的DNApPIC9K),經電泳檢測已經線性化(SalI酶切);
2DNA純化方法是經酚仿-氯仿兩步抽提后,無水乙醇沉淀的,目測定量應足夠;
3GS115甘油菌經新鮮平板復蘇后,5ML培養過夜,16h左右后,取菌1100稀釋,接種于70ml菌液擴大培養,14h后測得OD6001.3左右。
4、將sorbital、水和菌液均冰浴;
5、菌液離心5min100ml冰水洗滌-50ml冰水洗滌-4ml sorbital洗滌,然后溶解于300ulsorbital
6、加入約510ugDNA,槍吹勻,置0.2CM電轉杯靜置5min
7、電擊,1,5KV.
8、立即加入1ml冰浴的sorbital,靜止10min
9、取100ul轉化液,涂布10cmMD平板。
做了一點修改每塊板子大概能長100來個菌落(一般需要2天左右):
1、菌液收集時間:以前可能是OD值測得不太準確,我然后把菌液分別做了124816倍稀釋,看其OD值是否呈線性關系。1、菌液測OD值時,建議將菌液稀釋不同濃度測定,這樣才準確些。菌液看上去渾濁,但OD值不高,很可能就是你的OD稀釋倍數不夠!你分別稀釋2倍、4倍、8倍、10倍等,每個倍數做35個重復,應該可以大致推斷OD值是否準確!
2、我開始是先挑單克隆于5mlYPD中,過夜16h后,轉接于50mlYPD中,培養大概18個小時吧。OD值是否測準可以這樣估算:OD60040左右時,菌體濕重(6000rpm離心5min)約0.95g/10ml。高密度發酵時菌體濕重將相應下降。[OD,用什么作空白對照呢?菌體稀釋液,我一般使用PBS]
3、電擊條件等上面帖子上都有,1.5kv,放電4.85.5ms
2、其它做法相同,就是感受態做好后,zui后一次吸出sorbital時,不是直接倒調的,而是用毛細管輕吸出來的,這樣可能使剩下的感受態純凈些。
3、zui后用毛細管取出100ul出來,加入質粒,混勻!(我以前怕量不夠,吸得很多,電轉時效果反而不好。 )
4MD板子提前幾天做好,放在冰箱里,涂板的時候吸收效果會好些。如果是新板子,可能吸收不是太好,板子上有些積層,反而不利于生長。
5、你說的YNB,我用的是成品,只需要直接配制。42度水浴一會,然后過濾除菌。我沒有加硫酸銨。YNB是加到培養基里面的,去離子水pH偏低哦,我建議直接用蒸餾水就可以了(關系不是太大)。

方法三:簡便*
在篩選高表達菌種中,與大多數人和說明書有區別成功做出幾個基因):
每次轉化前,均用多種酶BlgII/salI/sacI同時切,轉化時,用GS115/KM71/KM71H同時轉化,轉化的條件也和大家一樣,即1.5/25/200,但是我用的是0.1的杯子,不是0.2的,轉化后涂MMYPD+0.25G,長出菌落后,即進行大規模的表達試驗,直接用YPD表達的,一般48h后即進行大量的SDS-PAGE鑒定,鑒定時,樣品不用濃縮,直接上樣,看到目的帶后再做PCR,測序。

方法四:沒有轉化子(無aaYNB和硫酸銨稱好后,去離子水溶解,然后高壓滅菌)
1.挑取酵母單菌落,接種至含有50ml YPD培養基的三角瓶中,30250-300rpm培養過夜約14hOD6001.3
2.菌液離心5min50ml冰水洗滌-25ml冰水洗滌-2ml sorbital洗滌,然后溶解于200ulsorbital;兩管分裝,每管100ul
3.加入約510ug的線性化的DNA20ul,槍吹勻,置0.2CM電轉杯冰浴5min
4.電擊,1,5KV.使用的是 Eppendorf 2510,用于轉化細菌及酵母。
5.立即加入1ml冰浴的sorbital,靜止1h
將菌體懸液涂布于MD平板上,每300µl涂布一塊平板;

方法五和說明書差不多的方法
X33菌株于100ml YPD搖到OD6001.1-1.3,太高影響感受態效率
(1)  15001700g離心5min,將離心管倒置在吸水紙上輕輕控幾下,充分棄上清
(2) 加入100ml 冰浴的超純水ddH2O,可在振蕩器上振蕩混勻,可靜置35分鐘
(3) 離心,棄上清,再加100ml ddH2O洗一遍
(4) 離心,棄上清,加20ml 冰浴1M Sorbitol洗一遍
(5) 離心,棄上清,菌體置于冰浴中,加入約100200ul Sorbitol混勻
加入Sorbitol量需自己調整,這時菌液很濃,只要能夠用200ul黃槍頭吸出來就可以了,一般共有約400500ul,夠做幾管感受態了。
(7) 吸取100150ul感受態到線性化的DNA中,用槍頭打勻或手指彈勻
靜置5min,于2mm電轉化杯中,電擊參數:1.5KV25uF200歐姆(不是400),一般放電時間在4.5-4.9ms之間,小于4說明你的DNA鹽濃度太高
(9) 立即加入1ml Sorbitol,轉入10ml 離心管,30度靜置1小時,然后加入1ml YPD30度,200rpm1小時,取50200ul菌液涂100ul/ml YPDS
(10) 一般轉化效率可以達到:200個以上轉化子每200ul菌液,足夠篩選表達菌株了。

方法六:酵母感受態細胞的制備
 接種Pichia pastoris GS1155 ml YPD液體培養基,30250~300250 rpm ,過夜。
 200µl的培養物接種至含有500ml新鮮培養基的三角搖瓶中,28~30250~300r/min培養過夜,一般12小時左右。
  將細胞培養物于45000g離心5min,用500ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸;
  按步驟3離心,用250ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸;
  按步驟3離心,用20ml的冰預冷的1M的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸;
  按步驟3離心,用1ml的冰預冷的1M的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸,其終體積約為2ml
  NOTE:可將其分裝為200µl一份的包裝冷凍起來,但如果保存時間過長會影響其轉化效率。

化學轉化

畢氏酵母氯化鋰轉化法
試劑
1. 1M LiCl:用去離子蒸餾水配制,濾膜過濾除菌;必要時用消毒去離子水稀釋
2. 50% PEG3350 Sigma P3640 用去離子蒸餾水配制,濾膜過濾除菌,用較緊的蓋子的瓶子分裝
3. 2mg/ml salmon sperm DNA / TE10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA-20保存
注:醋酸鋰對畢氏酵母無效,僅氯化鋰有效;PEG3350可屏蔽高濃度LiCl的毒害作用;

畢氏酵母的轉化
1. 煮沸1ml鮭魚精DNA 5min,迅速冰浴以制備單鏈擔體DNA
2. 將感受態酵母菌離心,以Tips去除殘余的LiCl溶液;
3. 對于每一個轉化,按以下順序加入:
50% PEG3350 240ul
1M LiCl 36ul
2mg/ml 單鏈Salmon sperm DNA 25ul
510ug/50ul H2O 質粒DNA 50ul
4. 劇烈旋渦混勻直至沉淀菌體*分布均勻(約1min);
5. 30水浴孵育30min
6. 42水浴熱休克2025min;
7. 60008000rpm離心收集酵母菌體;
8. 重懸酵母于1ml YPD培養基,30搖床孵育;
9. 14h后,取25100ul菌液鋪選擇性培養基平板,于30培養23天鑒定(將表達菌株和對照菌株在固體培養基平板,30'c培養至轉化子出現) 

畢氏酵母PEG1000轉化法

試劑
緩沖液A1.0M Sorbitol10mM BicinepH8.35sigma,3%v/vethylene glycol
緩沖液B40%w/vPEG1000sigma),0.2M BicinepH8.35
緩沖液C0.15M NaCl10mM BicinepH8.35
未污染的新鮮、試劑級DMSO-70保存
注:1. 緩沖液ABC均用濾膜過濾,-20保存;
2. DNA直接加在凍結的酵母細胞上是本實驗的關鍵之處(即使在冰上解凍的待轉化細胞,其攝取外源DNA的能力也在解凍過程中迅速下降;如進行多樣品的轉化,建議按6樣品/組進行);

待轉化畢氏酵母的制備
1. 接種環接種Pachia pastorisYPD平板,30培養2d;
2. 挑取單克隆酵母菌株于10mlYPD培養基中,30振蕩培養過夜;
3. 取步驟2中小量菌液接種到100mlYPD培養基中振蕩培養,待其OD值從0.1升到0.50.8
4. 室溫下3000g離心收集酵母菌體,50ml緩沖液A洗滌一次;
5. 重懸菌體于4ml緩沖液A中,按0.2ml/管分裝于1.5ml的離心管中,每管加入11ulDMSO,混合后迅速于液氮中冷凍,
6. -70保存

畢氏酵母的轉化
1. 將約50ug線性化質粒DNA溶于20ul TE或水中,直接加于凍結的酵母細胞中;加入擔體DNA40ug變性超聲線性化鮭魚精DNA)以獲得zui大轉化率;
2. 37水浴孵育5min,中間混合樣品12次;
3. 取出離心管,加入1.5ml緩沖液B,*混勻;
4. 30水浴孵育1h
5. 室溫下2000g離心10min,去除上清液,菌體沉淀重懸于1.5ml緩沖液C中;
6. 離心樣品,去除上清液,輕微操作將樣品重懸于0.2ml緩沖液C中;
7. 將所有轉化液鋪于選擇性平板,于30孵育34天后,鑒定;

畢赤酵母轉化方法有種。zui常用的是電轉化法和原生質體法,其中電轉化法zui為方便,轉化效率zui高,zui容易產生多拷貝整合。由于原生質體法必須首先制備去除細胞壁的原生質體細胞以利于DNA 進入,然后細胞再生細胞壁,產生轉化體,ZeocinR 抑制細胞壁的形成,導致不能產生轉化體。因此利用ZeocinR作為選擇標記的載體如p PICZ 系列,不能使用原生質體法進行轉化

 

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